罕见病的诊断和治疗一直是医疗领域的重点话题，长期以来，孟德尔遗传病的准确诊断一直困扰着临床工作者。在罕见孟德尔遗传病的诊断中，有的家族的“诊断旅程”甚至会长达三四十年，极大的影响患者的生活。但最近的一项研究让临床工作者和患者家属看到了新的希望，即转录组测序技术可以提高罕见孟德尔遗传病的诊断率，具体怎么回事呢，今天小编就为大家来揭秘~
2019年2月28日在美国权威期刊the american journal of human genetics发表了一篇关于转录组测序提高诊断罕见孟德尔遗传病的文章《expanding the boundaries of rna sequencing as a diagnostic tool for rare mendelian disease》[1]。接下来让我们看看转录组测序是如何发挥其强大的检测功能吧！
研究背景目前，基因panel和全外显子（wes）分析是孟德尔疾病突变检测的标准方法，然而，实现的诊断准确率最多为50％[2]。全基因组测序（wgs）是一种潜在的诊断策略，但还无法对有超过300万个snvs（single nucleotide variants）的样品进行数据精准分析，有证据表明9％至30％的非编码区致病突变会影响rna的加工和表达[3]。此外，非编码区以及影响rna剪接和表达的编码区的突变位点变化通常需要在转录水平上进行额外的功能研究。
作者对基因panel或wes诊断为阴性的病例进行了转录组分析，诊断出36%（9/25）为阳性，在编码和非编码外显子以及内含子区域中鉴定了致病突变，突变的病理机制由转录抑制、外显子跳跃和内含子保留等可变剪切事件造成。
研究策略01 样品选择29个家族（其中4个家族已经被鉴定为阳性病例，其余25个家族的样品经过基因panel或wes分析鉴定为阴性）的70个样品，从肌肉活组织，成纤维细胞和t-肌管中提取总rna，进行rna-seq。
02 rna-seq诊断算法将未诊断的个体转录组数据（25个家族）与数据库和从gtex（genotype-tissue expression project健康个体）获得的对照转录组数据进行比较分析。
03 将已知的神经肌肉疾病中突变的基因（n=132）作为鉴定突变的验证基因，然后聚焦于以下几个方面进行分析（图1）：a.新的剪接事件，b.等位基因不平衡表达，c.基因差异表达的统计学显著性，d.临床相关的罕见序列突变。
图1 诊断方案梗概[1]
研究结果01 rna-seq验证选材的适宜性
通过对不同组织样品的相关性验证得出：实验组的肌肉组织与健康组的肌肉组织相关性最高，说明实验组的取样比较适宜。而血液样品对于诊断神经肌肉型病例不是理想的诊断材料。
图2 样品分布和基因表达谱[1]
02 rna-seq鉴定样品的低频新剪接事件
rna加工中的异常是潜在的突变病理机制，rna-seq可以捕获这种异常。在25个经poly a富集的肌肉组织转录本中，鉴定了166个新的剪接位点， 其中84个在样品组中以低频率存在（定义为低频新剪接事件low-frequency novel junctions，lfnjs），变异类型分为新受体、新供体、外显子跳跃和伪外显子。
图3 低频新剪接事件[1]
03 rna-seq鉴定基因组突变位点、表达异常和等位基因不平衡表达
在9个病例中鉴定了致病突变位点，另外在5非翻译区（utr）中发现了罕见突变位点。7个先前未确诊的家族中发现候选基因表达异常。在ryr1（异常连接）和gmppb（5 utr突变体）突变的情况下观察到等位基因失衡，在3例病例中，等位基因不平衡表达是致病因素。
图4 对突变位点、表达图谱、等位基因不平衡表达[1]
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通过对假阴性样品转录组数据与健康对照组以及数据库进行比对分析得出孟德尔遗传病的突变位点、剪接位点、等位基因表达不平衡等，实现对假阴性罕见孟德尔遗传病的诊断，可作为临床诊断的补充。总之，rna-seq可缩短罕见孟德尔遗传病的“诊断旅程”，为患者带来新的希望。
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参考文献：
[1] hernan d. gonorazky, sergey naumenko, arun k. ramani, et al. expanding the boundaries of rna sequencing as a diagnostic tool for rare mendelian disease[j]. the american journal of human genetics, 2019, 104(3):466-483.
[2] kress w, rost s, kolokotronis k, et al. the genetic approach: next generation sequencing based diagnosis of congenital and infantile myopathies/ muscle dystrophies[j]. neuropediatrics, 2017: s-0037-1602660.
[3] stenson p d, mort m, ball e v, et al. the human gene mutation database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies[j]. human genetics, 2017, 136(6):665-677.
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